PCR(聚合酶链式反应)几乎是分子实验室里最常见的技术之一。但有时候，做着做着，条带就是不上镜：要么无条带，要么全是拖尾，要么阴性对照还神奇地亮了……

别急！今天我们就来盘点 PCR失败的5个常见原因，并提供实用的解决办法，帮你少踩坑。

1️⃣ 模板DNA质量或浓度不合适

表现：无条带、条带过弱或拖尾。

原因：DNA降解、杂质残留，或者浓度过低/过高。

✅ 解决办法：

保证DNA纯度(A260/A280 = 1.8–2.0)；稀释过浓模板；植物/土壤等样本建议用高纯度提取试剂盒。

2️⃣ 引物设计或浓度有问题

表现：非特异性条带、引物二聚体。

原因：引物设计不合理，浓度过高/过低。

✅ 解决办法：

长度18–25 bp，GC含量40–60%；

避免3’端互补；

终浓度一般0.1–0.5 μM，必要时做梯度PCR优化。

3️⃣ PCR体系或酶活性问题

表现：完全无扩增或扩增效率低。

原因：Taq酶失活、Mg²⁺浓度不合适、dNTP降解。

✅ 解决办法：

分装保存酶，避免反复冻融；

优化Mg²⁺浓度(1.5–2.5 mM)；

用新鲜dNTP；

推荐选择性能优异的PCR预混液 ???? 预混液中已优化了缓冲体系和酶活性，能显著提升扩增成功率，减少反复调试的时间，非常适合常规科研实验。

4️⃣ 实验操作污染

表现：阴性对照也出现条带。

原因：PCR产物残留、移液器污染、空气中DNA污染。

✅ 解决办法：

严格分区操作(提取区/体系配置区/产物分析区分开)；

用带滤芯的枪头；

定期清洁实验台，使用核酸去除剂。

5️⃣ 循环条件设置不当

表现：条带模糊、非特异性扩增或无结果。

原因：退火温度过低/过高、延伸时间不足、循环数过多。

✅ 解决办法：

根据引物Tm值设置退火温度；

延伸时间约 1 kb/min；

循环数控制在30–35次。

总结

PCR失败并不可怕，常见问题主要集中在模板、引物、体系、操作和循环条件这五个方面。逐一排查，总能找到原因。

而对于高校实验室或科研人员来说，选择一款高性能PCR预混液，往往能让PCR事半功倍，节省大量试错时间。

科研路上，少一点弯路，多一点高效！