广州东盛生物科技有限公司
Guangzhou Dongsheng Biotech Co., Ltd.
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Pfu DNA高保真聚合酶
PCR/RT-PCR >> PCR试剂

品牌: 东盛
产地: 广州
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P1022250 U190
P10241,000 U640
品牌:东盛
产地:广州
产品介绍

产品组分

 P1021
 Pfu DNA聚合酶 2.5 U/μl 100 μl
 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) 1.25 ml
 6×Loading Buffer 1 ml
 P1022
 Pfu DNA聚合酶 2.5 U/μl 100 μl
 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) 1.25 ml
 dNTPs(各2.5 mM) 1 ml
 6×Loading Buffer 1 ml
 P1023
 Pfu DNA聚合酶 2.5 U/μl 400 μl
 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) 1.25 ml×2
 6×Loading Buffer 1 ml
 P1024
 Pfu DNA聚合酶 2.5 U/μl 400 μl
 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) 1.25 ml×2
 dNTPs(各2.5 mM) 1 ml
 6×Loading Buffer 1 ml

注: 10×Pfu Buffer分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装,可方便选择。如没特别说明提供10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus)。Mg2+ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2
 
保存条件
    -20℃保存2年。多次冻融不影响生物学活性。
 
产品说明
    Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶,分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为0.2-0.4 kb/ min(70~75℃)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。扩增产物具有平末端。
 
产品特点
    保真性最高:保真性是Taq DNA聚合酶的10倍。
    热稳定性好:95℃处理2小时后,酶活性为未经处理酶的95%。
    PCR产物具有平滑末端,可直接用于平端克隆。
 
产品用途
    高保真性PCR扩增
    制备基因克隆或蛋白表达用的PCR产物
    平末端PCR克隆
    位点特异性突变
 
活性定义
    一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,在72℃、30 min内,摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
 
质量控制
    相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染;PCR方法检测无宿主残余DNA,能有效扩增人基因组中的单拷贝基因;室温放置一周,扩增活性无明显改变。
 
10×Pfu Buffer
  100 mM KCl
  200 mM Tris-Cl
  20 mM MgSO4
  100 mM (NH4)2SO4
 
酶贮存液
  20 mM Tris-HCl
  1 mM DTT
  0.1 mM EDTA
  100 mM KCl
  0.5 % TW 20
  0.5 % NP 40
  50 % Glycerol
 
应用举例
注:以下反应举例为50 μl标准PCR体系,仅供参考。实际PCR条件应根据模板、引物结构、目的片段大小加以优化,确定最佳反应条件。
以λ DNA为模板,扩增1kb片段。

 λ DNA(2.5 ng/μl) 1 μl
 引物1(10 μM) 2 μl
 引物2 (10 μM) 2 μl
 10×PCR Buffer 5 μl
 dNTPs(2.5 mM/L) 4 μl
 Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μl) 1 μl
 超纯水 补足至50 μl

 
PCR反应条件

 95℃ 3 min
 95℃ 30 sec
 55~68℃ 30 sec  30 Cycles
 72℃ 2 min
 72℃ 7 min

 
注意事项
    1、Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端,可直接用于平末端连接。
    2、dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。
    3、建议在冰上配置PCR 反应液后,再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性,减少非特异性扩增,得到良好的PCR结果。
    4、碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。
    5、模板DNA推荐用量(50 μl PCR反应体系)

 人类基因组DNA 0.1 – 1 μg
 λDNA 0.5 – 5 ng
 质粒DNA 0.1 – 10 ng
 大肠杆菌DNA 10 – 100 ng

 
Q&A
问:Pfu DNA聚合酶的保真性为何高于Taq DNA聚合酶?
答:这是由于Pfu DNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性,可在扩增的过程中,切掉错配的碱基,降低碱基错配率。Taq DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-5,而Pfu
DNA聚合酶的碱基错误率仅为1×10-6。Pfu DNA聚合酶主要用于基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等对保真性有很高要求的实验。其扩增产物只具有
平末端,可直接用于平末端连接。要提高TA克隆效率,建议对PCR产物纯化后,加A再进行TA克隆。
 
问:Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段?
答:对于简单模板,可以扩增2 kb以下的片段。扩增长片段时,能否扩增成功主要与模板与引物的设计有关。为获得良好的扩增结果,建议引物长度大于18 bp,
Tm在55-80℃之间,浓度在0.1-0.5μM之间,略高于Taq。如需要很高的保真性,且又扩增较长片段时,建议选择Fusion pfu DNA聚合酶。
 
问:Pfu DNA聚合酶的扩增效率为何低于Taq DNA聚合酶?
答:这可能决定于Pfu DNA聚合酶本身的结构与特性。且具有核酸外切酶的活性,容易降解PCR引物。建议在配制PCR反应时,最后加入Pfu DNA聚合酶或使用
PfuMix。
 
问:使用Pfu DNA聚合酶扩增时,有没有必要在冰上配制PCR反应液?
答:有必要。建议在冰上配制PCR 反应液后,再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性,减少非特异性条带背景,获得良好的PCR结果。

 

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